結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（M.tb)引起的，而艾滋病則是由人類免疫缺陷病毒（HIV）引起。一個是細(xì)菌，是病毒，它們卻能"狼狽為奸"，給患者帶來雙重打擊。
據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）最新的數(shù)據(jù)顯示，2022年，結(jié)核病導(dǎo)致130萬人死亡，其中16.7萬是HIV感染者。HIV感染會使感染者患結(jié)核病的風(fēng)險增加20倍，同樣，結(jié)核分枝桿菌感染也會加劇艾滋病患者的癥狀1。
隨著時間的推移，結(jié)核病和艾滋病患者可能面臨病原體耐藥性增加的風(fēng)險。WHO將抗病原微生物藥物耐藥列為全球十大公共衛(wèi)生威脅之一。為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，基于大規(guī)模平行測序技術(shù)（MPS）的靶向測序技術(shù)被證明在微生物溯源和耐藥基因的發(fā)現(xiàn)方面優(yōu)勢突出，與傳統(tǒng)分子檢測方法相比，兼顧檢測特異性和敏感性的同時，能提供更全面的變異信息。
華大智造ATOPlex多重PCR建庫平臺以超高重PCR技術(shù)為核心，能夠同時對多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行靶向擴(kuò)增，panel可定制，對投入DNA完整性要求低，擴(kuò)增可在一管中進(jìn)行且具有防污染體系，搭配華大智造測序儀和自動化平臺可實現(xiàn)高質(zhì)量靶向測序。
在公共衛(wèi)生領(lǐng)域，基于ATOPlex多重PCR建庫平臺，華大智造已推出針對新冠、甲流乙流、猴痘、登革熱等多種傳染性疾病的即用型全流程測序組合產(chǎn)品。近期，華大智造新推出了針對HIV病毒和結(jié)核分枝桿菌的兩款靶向擴(kuò)增測序組合產(chǎn)品，全面涵蓋HIV病毒和結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因檢測的建庫-測序-分析全流程。
ATOPlex技術(shù)特點
HIV-1耐藥測序組合產(chǎn)品
華大智造基于DNBSEQ-G99、DNBSEQ-E25和MGISEQ-200測序平臺，現(xiàn)正式推出HIV-1耐藥測序組合產(chǎn)品，用基因科技賦能艾滋病防 控。該組合產(chǎn)品基于ATOPlex文庫制備試劑，搭配自主研發(fā)的自動化樣本制備系統(tǒng)和分析軟件，覆蓋建庫，測序及報告產(chǎn)出全流程，可對樣本中的HIV-1病毒進(jìn)行快速、精準(zhǔn)的耐藥檢測和分型。
支持低頻耐藥位點檢測
基于深度測序，能夠檢出Sanger測序無法檢出的頻率低于20%的耐藥位點。
自動化程度高
搭配自動化文庫制備系統(tǒng)MGISP-100、MGISP-960及HIV-GenomePro生信分析平臺，可實現(xiàn)自動化建庫和數(shù)據(jù)分析，省時省力。
分析功能豐富
HIV-GenomePro軟件具有病毒分型、基因組裝、變異檢測和進(jìn)化溯源分析等功能，可實現(xiàn)耐藥位點的精準(zhǔn)預(yù)測和注釋，還可合并多樣本組裝序列進(jìn)行HIV-trace分析，獲得分子網(wǎng)絡(luò)圖。
HIV-1耐藥測序組合產(chǎn)品全流程
以從血漿和培養(yǎng)毒株中提取的RNA為樣本進(jìn)行文庫制備，基于DNBSEQ-G99ARS平臺進(jìn)行測序與分析，并與Sanger測序結(jié)果進(jìn)行對比。
利用HIV-1耐藥測序組合產(chǎn)品得到的測序結(jié)果與Sanger測序方案所得的序列一致性＞98%，分型結(jié)果基本一致。
HIV-1耐藥測序組合產(chǎn)品能檢出Sanger測序方案無法檢出的低頻突變（紅色標(biāo)記的耐藥位點），括號內(nèi)為突變頻率。
以從培養(yǎng)毒株中提取的RNA為樣本（參考耐藥位點: Y115F, M184V, K219E, K103N, E138G, V179E），進(jìn)行濃度梯度稀釋后，分別進(jìn)行文庫制備、測序與分析，當(dāng)反應(yīng)中的病毒拷貝數(shù)為7.67E+02的時候，所有參考耐藥位點均能被準(zhǔn)確檢出。因此最低檢測限可低至102cps/rxn。各個突變位點的突變頻率在不同濃度梯度中也均極為接近，表明具有優(yōu)異的重復(fù)性。
HIV-GenomePro分析軟件具有豐富的功能，如基因組裝、耐藥位點注釋、進(jìn)化溯源分析等。
基因深度覆蓋圖，“深度覆蓋圖”展示了每個染色體/基因組片段的reads深度覆蓋情況，X軸為染色體/基因組片段的堿基坐標(biāo)，Y軸為reads深度的lg轉(zhuǎn)換值。
耐藥分析結(jié)果
進(jìn)化溯源分析圖
ATOPlex結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增測序組合產(chǎn)品
基于ATOPlex多重PCR技術(shù)，華大智造推出ATOPlex MTB建庫試劑盒，結(jié)合DNBSEQ測序平臺，可對結(jié)核分枝桿菌的耐藥和鑒定區(qū)域進(jìn)行快速、精準(zhǔn)的靶向測序。同時MTB-Explorer軟件可對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTBC）和分枝桿菌進(jìn)行分型、變異檢測、耐藥預(yù)測、進(jìn)化溯源等自動分析，并生成報告。此組合產(chǎn)品覆蓋建庫、測序到報告產(chǎn)出全流程，可全面助力公共衛(wèi)生防控。
樣本無需培養(yǎng)
此組合產(chǎn)品支持痰液、灌洗液等混合樣本輸入，無需進(jìn)行微生物培養(yǎng)。
建庫操作簡便
基于ATOPlex多重PCR建庫平臺，僅需單管內(nèi)2步擴(kuò)增即可實現(xiàn)靶區(qū)域擴(kuò)增建庫。
軟件分析功能全
參考WHO發(fā)布的《結(jié)核耐藥相關(guān)變異目錄》注釋變異，全面覆蓋一、二級耐藥相關(guān)變異超1200個；涵蓋目錄收錄的15種一線、二線抗結(jié)核藥物耐藥基因信息；52個基因或基因片段的變異信息；支持結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTBC）鑒定，spoligotype分型鑒定；174種分枝桿菌鑒定、進(jìn)化溯源分析。
全流程速度快
搭配DNBSEQ-G99ARS測序儀，從核酸到報告全流程最快24h完成；適配DNBSEQ-E25測序儀，從核酸到報告全流程最快30h完成。
ATOPlex結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增測序組合產(chǎn)品全流程
MTB-Explorer分析軟件能夠?qū)ν慌畏治龅乃袠颖旧蓞R總報告，點擊對應(yīng)鏈接可打開單個樣本報告；基本信息頁面展示樣本的分枝桿菌鑒定結(jié)果，分枝桿菌感染類型，樣本中分枝桿菌的豐度比例（MTB reads/NTM reads %），彩色總覽圖能夠直觀的展示出樣本中所檢出的15種藥物對應(yīng)的耐藥變異位點的個數(shù)。
耐藥報告結(jié)果總覽
*備注：標(biāo)題表示該樣本的名稱和譜系，彩色外圈表示W(wǎng)HO收錄的與抗結(jié)核藥耐藥相關(guān)的變異數(shù)目，灰色內(nèi)圈表示該樣本所檢測到的對應(yīng)的耐藥基因變異數(shù)目。
突變檢測報告頁面展示樣本中檢測到的所有突變數(shù)目，耐藥相關(guān)突變數(shù)目（收錄于WHO耐藥變異目錄的一、二級變異）；不確定顯著性突變和耐藥不相關(guān)突變的檢測數(shù)目（收錄于WHO耐藥變異目錄的三、四和五級變異）；其他突變的檢測數(shù)目（未被WHO目錄收錄的變異），報告表格還展示每個變異位點的突變頻率、突變堿基測序深度、耐藥置信水平注釋；IGV圖為每個變異在基因組上對應(yīng)位置的突變堿基測序深度情況提供可視化窗口。
突變數(shù)目及突變類別統(tǒng)計
IGV圖
MTB-Explorer軟件匯總報告能夠為同一批次分析的所有樣本自動構(gòu)建進(jìn)化樹和SNP距離分析熱圖。
進(jìn)化樹分析圖
SNP距離分析熱圖
結(jié)語
華大智造HIV-1耐藥測序組合產(chǎn)品及ATOPlex結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增測序組合產(chǎn)品，數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量優(yōu)異，軟件功能強(qiáng)大，能夠為病原體的變異監(jiān)測和耐藥分析提供強(qiáng)大的工具支撐。
在公共衛(wèi)生領(lǐng)域，華大智造已形成病原微生物宏基因組測序、靶向測序、全基因組測序等應(yīng)用場景的全流程產(chǎn)品組合。未來，秉承著“創(chuàng)新智造引領(lǐng)生命科技”的理念，華大智造將持續(xù)創(chuàng)新，為病原微生物的鑒定、耐藥和溯源分析提供更自動、更便捷、更高效的自主核心工具，為公共衛(wèi)生防控事業(yè)添磚加瓦。
參考文獻(xiàn)1.Azevedo-Pereira J M, Pires D, Calado M, et al. HIV/Mtb co-infection: from the amplification of disease pathogenesis to an “emerging syndemic”[J]. Microorganisms, 2023, 11(4): 853.
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