導(dǎo)讀：
猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）是一種長(zhǎng)度為197kb的雙鏈DNA病毒，由大約200個(gè)基因組成，可在人類和野生動(dòng)物中引起疾病。近年來(lái)，人類猴痘病例逐漸增多，已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。
核酸擴(kuò)增和血清學(xué)檢測(cè)能以低成本快速診斷猴痘病例，但這些檢測(cè)不能用于監(jiān)測(cè)MPXV的來(lái)源、譜系、傳播和基因組變異。新出現(xiàn)的變異可能會(huì)使得樣本中的病毒載量被低估，甚至導(dǎo)致誤診。為了更好地開(kāi)展MPXV感染的預(yù)防和治療，有必要制定具有成本效益和高質(zhì)量的MPXV全基因組測(cè)序策略。
近日，來(lái)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所、重慶市疾病預(yù)防控制中心、華大智造等單位的研究團(tuán)隊(duì)在Virologica Sinica期刊發(fā)表了題為“Rapid identification of full-length genome and tracing variations of monkeypox virus in clinical specimens based on mNGS and amplicon sequencing”的文章。研究團(tuán)隊(duì)利用多種測(cè)序平臺(tái)對(duì)獲取的猴痘病例樣本開(kāi)展了mNGS（宏基因組測(cè)序）和擴(kuò)增子測(cè)序及對(duì)比分析，并對(duì)這些平臺(tái)的周轉(zhuǎn)時(shí)間和所需成本進(jìn)行了估算。研究顯示，采用華大智造研發(fā)的DNBSEQ-G99進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序的覆蓋率達(dá)99.66%，能夠?qū)εR床樣本進(jìn)行快速測(cè)序，從而促進(jìn)獲得高質(zhì)量的MPXV基因組序列。
值得注意的是，該研究采用了DNBSEQ-G99測(cè)序平臺(tái)具備的多時(shí)點(diǎn)數(shù)據(jù)輸出模式（Bioanalysis by Sequencing, BBS），可在2小時(shí)內(nèi)完成初始數(shù)據(jù)處理并給出分析報(bào)告，在12小時(shí)內(nèi)獲得完整病毒基因組，大大縮短了MPXV測(cè)序所需的時(shí)間，具有成本效益和高效率。BBS技術(shù)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心與華大智造聯(lián)合研發(fā)，并于2021年公布。
文章發(fā)表在Virologica Sinica
多種策略結(jié)合獲取MPXV基因組信息
MPXV基因組測(cè)序的主要策略是宏基因組和擴(kuò)增子測(cè)序。MPXV只占臨床樣本總DNA的一小部分（不到1%），為了對(duì)MPXV基因組進(jìn)行測(cè)序，必須從臨床樣本中分離病毒并進(jìn)行培養(yǎng)，然后再進(jìn)行基因組測(cè)序。病毒分離耗時(shí)且需要嚴(yán)格的條件。相反，擴(kuò)增子可用于富集或擴(kuò)增病毒核酸。在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)利用宏基因組和擴(kuò)增子測(cè)序方法來(lái)準(zhǔn)確鑒定MPXV的完整基因組。擴(kuò)增子測(cè)序成本低和效率高，使得臨床樣本能夠快速測(cè)序，從而有助于獲得高質(zhì)量的MPXV基因組序列。
擴(kuò)增子測(cè)序
在擴(kuò)增子測(cè)序中，使用ATOPlex平臺(tái)對(duì)猴痘參考基因組（NC_063383.1）設(shè)計(jì)PCR引物（含739對(duì)擴(kuò)增子，擴(kuò)增子長(zhǎng)度：313-395bp），并進(jìn)行猴痘病毒的基因組擴(kuò)增，使用MGIEasy Fast PCR-Free FS DNA library Prep Kit制備擴(kuò)增子測(cè)序文庫(kù)，在DNBSEQ-G99平臺(tái)上采用SE100+10+10測(cè)序策略對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。
宏基因組測(cè)序
在mNGS中，完成測(cè)序文庫(kù)制備步驟后，將制備的DNB加載到規(guī)則陣列載片上，在華大智造測(cè)序平臺(tái)DNBSEQ-G99（BBS模式，PE100+10+10）和DNBSEQ-G400*（PE100+10+10）上進(jìn)行測(cè)序。
BBS技術(shù)助力快速生成高質(zhì)量MPXV基因組
在傳染病防控中，特別是未知病原體的鑒定，時(shí)間至關(guān)重要。研究團(tuán)隊(duì)估計(jì)了上述分析所需的時(shí)間。對(duì)比周轉(zhuǎn)時(shí)間，在擴(kuò)增子測(cè)序及分析中， DNBSEQ-G99為12小時(shí)；
在mNGS中，DNBSEQ-G99為12小時(shí)。在擴(kuò)增子數(shù)據(jù)集中， DNBSEQ-G99的10×覆蓋率最高，為99.66%，在mNGS數(shù)據(jù)集中，DNBSEQ-G99、DNBSEQ-G400*測(cè)序水皰液樣本的10×覆蓋率最高分別為99.93%、99.99%。
DNBSEQ-G99的多時(shí)點(diǎn)數(shù)據(jù)輸出模式（bioanalysis by sequencing, BBS)，可縮短交付時(shí)間，該系統(tǒng)可在運(yùn)行后2小時(shí)內(nèi)完成初步分析，并在12小時(shí)內(nèi)完成PE150測(cè)序，新技術(shù)的應(yīng)用大大縮短了MPXV測(cè)序所需的時(shí)間，在極致快速的基礎(chǔ)上更快一步，且測(cè)序讀長(zhǎng)不受限，更加適用于公衛(wèi)系統(tǒng)緊急多元的檢測(cè)場(chǎng)景。對(duì)于病毒載量較低的口腔拭子樣本（Ct=27.81），也能夠在12小時(shí)內(nèi)獲得完整的病毒基因組序列。
總體分析來(lái)看，DNBSEQ-G99的耗時(shí)短，覆蓋率高，reads數(shù)量大，可滿足MPXV基因組測(cè)序需求。考慮到成本，研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，mNGS適用于對(duì)皰液等高病毒載量樣本進(jìn)行測(cè)序，其應(yīng)用于口咽拭子等低病毒載量樣本會(huì)導(dǎo)致成本過(guò)高。擴(kuò)增子測(cè)序是提高基因組質(zhì)量同時(shí)顯著降低費(fèi)用的一個(gè)有效方法。
值得一提的是，在該研究中，研究團(tuán)隊(duì)采用DNBSEQ-G99成功地對(duì)2022年9月中國(guó)內(nèi)地報(bào)道的第一例輸入性猴痘病例以及2023年6月初發(fā)現(xiàn)的一例病例進(jìn)行了突變分析，并對(duì)病毒基因組進(jìn)行了溯源分析。2022年9月，剛剛發(fā)布的華大智造基因測(cè)序儀DNBSEQ-G99，首次應(yīng)用于傳染病防控，助力該次溯源測(cè)序得到了高度可信的毒株序列全長(zhǎng)。
結(jié)語(yǔ)
該研究表明，目前的主流測(cè)序平臺(tái)能夠滿足MPXV全基因組測(cè)序的要求，并準(zhǔn)確識(shí)別樣本中的基因組變異位點(diǎn)。病毒感染樣本測(cè)序策略的選擇應(yīng)結(jié)合樣本數(shù)量、預(yù)期持續(xù)時(shí)間和成本等因素仔細(xì)考慮。對(duì)于高病毒載量的樣本，如水皰液，mNGS和擴(kuò)增子測(cè)序都可以產(chǎn)生高質(zhì)量的全長(zhǎng)病毒基因組。對(duì)于病毒載量較低的樣本，如口咽拭子，由于需要大量的測(cè)序數(shù)據(jù)，因此不建議直接進(jìn)行mNGS，成本較高，擴(kuò)增子測(cè)序可高效地對(duì)臨床樣本進(jìn)行測(cè)序且成本較低。
研究團(tuán)隊(duì)將各種新的測(cè)序技術(shù)與擴(kuò)增子富集策略相結(jié)合。即使對(duì)于低病毒載量的口腔拭子樣本，也能使用DNBSEQ-G99在運(yùn)行后2小時(shí)內(nèi)完成初步分析，在12小時(shí)內(nèi)獲得完整的病毒基因組序列，大大縮短了MPXV測(cè)序所需的時(shí)間，為監(jiān)測(cè)變異和對(duì)MPXV等重要病原體發(fā)出早期預(yù)警提供了重要幫助。
針對(duì)新發(fā)未知病原體的快速識(shí)別和溯源需求，華大智造基于自主研發(fā)的試劑、儀器和軟件打造了病原微生物高通量測(cè)序產(chǎn)品組合，覆蓋從樣本到報(bào)告輸出全流程，是猴痘病毒識(shí)別和溯源的理想工具。該產(chǎn)品組合可兼容DNBSEQ-G99、DNBSEQ-E25、MGISEQ-200和MGISEQ-2000等測(cè)序儀, 文庫(kù)制備與數(shù)據(jù)分析均實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作。華大智造獨(dú)有的DNBSEQ技術(shù)，為病原體的識(shí)別和溯源保障高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)。
華大智造病原微生物測(cè)序產(chǎn)品組合
1.擴(kuò)增子測(cè)序方案
ATOPlex多重PCR技術(shù)開(kāi)發(fā)的猴痘病毒擴(kuò)增子測(cè)序Panel，含739重PCR引物，覆蓋病毒全長(zhǎng)基因組，可對(duì)病毒進(jìn)行相對(duì)定量，用于猴痘病毒的快速鑒定和溯源。
MPXV分析軟件具備猴痘病毒的鑒定，變異檢測(cè)以及株系分型等功能，能夠快速、準(zhǔn)確的對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
2.mNGS方案
使用MGIEasy Fast FS DNA Library Prep set對(duì)樣本進(jìn)行文庫(kù)制備，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)樣本中未知病原進(jìn)行鑒定和溯源。
PFI分析軟件可以對(duì)未知病原進(jìn)行快速鑒定，MGAP分析軟件，可以對(duì)病原進(jìn)行基因組組裝等分析。
靶向測(cè)序（Targeted Next-Generation Sequencing，tNGS）因其針對(duì)特定基因或基因區(qū)域進(jìn)行深度測(cè)序的能力而備受關(guān)注。tNGS主要分為基于引物 PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增子測(cè)序和基于探針雜交的雜交捕獲測(cè)序兩種方法。
病原靶向測(cè)序（tNGS）在病原微生物檢測(cè)上比較熱門(mén)，主要是將多重PCR擴(kuò)增與測(cè)序技術(shù)結(jié)合，能夠?qū)Υ郎y(cè)樣本中幾十種至幾百種病原微生物及其毒力和/或耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。
華大智造ATOPlex平臺(tái)采用自主研發(fā)的單管超高重PCR技術(shù)，可提供個(gè)性化的多重PCR引物池，以及包括對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增體系在內(nèi)的一整套靶向建庫(kù)試劑。在靶向測(cè)序方面，表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，現(xiàn)已全面覆蓋DNA、RNA和甲基化靶向捕獲三個(gè)方向，適用于分子育種、遺傳病研究、公共衛(wèi)生等多種方向的應(yīng)用。
* 本文部分轉(zhuǎn)載自測(cè)序中國(guó)；點(diǎn)擊文末“閱讀原文”，查看文章鏈接
* DNBSEQ-G400，國(guó)內(nèi)產(chǎn)品名為MGISEQ-2000
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