水稻，作為是世界上重要的糧食作物之一，為全世界超過35億人的主食，維系超過10億人的生計。因此，稻米對全球糧食安全至關(guān)重要，提升稻米生產(chǎn)系統(tǒng)的效率是應(yīng)對糧食安全挑戰(zhàn)的關(guān)鍵一環(huán)。野生近緣種為水稻提供了寶貴的遺傳資源。生長于西非熱帶地區(qū)的長雄野生稻（又稱非洲野生稻，Oryza longistaminata）表現(xiàn)出多年生生長和極高的生物量生產(chǎn)能力，相關(guān)有益等位基因已經(jīng)被轉(zhuǎn)移到商業(yè)水稻品種中。除了對育種的貢獻外，長雄野生稻也是研究根莖遺傳基礎(chǔ)和發(fā)育方面的重要研究對象。
長雄野生稻 (2x=2n=12) 主要生長在西非的熱帶地區(qū)，是一種AA基因組型，主要生長在靠近淡水資源和沼澤的地區(qū)。雖然很少用于人類食用，但該物種具有抵抗力高、根莖無性繁殖和生物脅迫等多種有益的特性。由于測序技術(shù)限制和基因組復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，此前的非洲野生稻的參考基因組中仍然存在未被充分展現(xiàn)的復(fù)雜區(qū)域，這限制了對其開展深入且詳盡的研究工作。
為解決這一問題，近日，華大研究院聯(lián)合云南大學(xué)，依托華大序風(fēng)的CycloneSEQ納米孔測序平臺，完成長雄野生稻343 Mb的端粒到端粒(T2T)的基因組組裝，涵蓋了12條染色體上的所有端粒和著絲粒，新組裝的基因組比以前版本有了明顯的改進，為栽培稻野生近緣種中有益等位基因的探索和開發(fā)提供了寶貴的資源。
基因組組裝
對培育的長雄野生稻嫩葉提取DNA后進行測序，獲得25.6 Gb CycloneSEQ超長序列數(shù)據(jù)，21 Gb MGI-Seq雙端測序數(shù)據(jù)，27.3 Gb PacBio HiFi數(shù)據(jù)，32 Gb Hi-C數(shù)據(jù)。使用K-mer評估基因組大小為357 Mb，雜合度為1.27%?；旌辖M裝首先獲得了一個343 Mb基因組，contig N50為26.02Mb，隨后使用Hi-C數(shù)據(jù)將組裝序列合并為12個假染色體，使用TGS-gapcloser填補剩余空白。利用端粒重復(fù)序列鑒定到基因組全部的24個端粒，鑒定到染色體的著絲粒區(qū)域長度在0.3 Mb至1.8 Mb之間。在組裝基因組準(zhǔn)確性和完整度評估方面，雙端測序數(shù)據(jù)比對率達97.27%，BUSCO分析完整度達到98.6%，LTR組裝指數(shù)（LAI）為20.71（符合參考基因組金標(biāo)準(zhǔn)），Merqury組裝質(zhì)量QV值達到52.08（即堿基準(zhǔn)確率高于99.999%）。與之前已發(fā)表的長雄野生稻基因組(Reuscher et al., 2018)進行編碼基因共線性比較分析，在基因組范圍鑒定出28,627個共線性編碼基因，與預(yù)期一致，表明組裝的T2T基因組與已發(fā)表的基因組具有高度一致性。
基因組注釋
使用從頭分析和同源比較分析，在基因組中鑒定出134 Mb重復(fù)序列，大約占全基因組的40.73%。重復(fù)序列在12個染色體和全基因組水平上高度一致。LTR和DNA轉(zhuǎn)座子為主要的重復(fù)單元，分別占據(jù)大約20.9%和18.5%。重復(fù)水平達到中度，與其他稻屬的其他基因組相近?；蚪M的著絲粒由于其高度重復(fù)，組裝難度較高。本次組裝的T2T基因組發(fā)現(xiàn)著絲粒區(qū)域飽含轉(zhuǎn)座元件并只含有少量基因。著絲粒區(qū)域中， LTR中大部分為Gypsy元件。
基因組中預(yù)測出有33,177個編碼基因，平均長度2,439 bp，平均編碼序列長度達到1,138 bp。功能分析顯示95.74%的編碼基因可在蛋白公共數(shù)據(jù)庫被注釋，展示了基因預(yù)測的準(zhǔn)確性高。
長雄野生稻的T2T基因組組裝
（從外到內(nèi)：GC含量、蛋白編碼基因、重復(fù)序列、LTR-Gypsy、HTR-Copia、共線性區(qū)塊）
基因組結(jié)構(gòu)變異
栽培稻與長雄野生稻的全基因組結(jié)構(gòu)變異推測發(fā)現(xiàn)，兩個基因組間包含3,738,150個SNP位點，204個倒置區(qū)塊，11,706個重復(fù)區(qū)域，11,175個倒置重復(fù)，3,077個移位和3,015個倒置移位。超105 Mb的結(jié)構(gòu)變異顯示出兩個物種間的巨大差異。GO分析結(jié)構(gòu)變異相關(guān)基因展示出與催化活性、嘌呤核糖核苷酸結(jié)合、腺苷核糖核苷酸結(jié)合和端粒維持的相關(guān)性。
栽培稻與長雄野生稻T2T基因組的共線性分析和變異分析
（Reference基因組為 O. sativia，Query基因組為 O. longistaminata）
基因組片段重復(fù)分析
片段重復(fù)（Segmental Duplications, SDs）是指基因組中大于1 Kb的至少有90%序列一致性的重復(fù)片段。SD中常含大量重復(fù)基因，在基因創(chuàng)新中有重要作用。先前基因組中不準(zhǔn)確的SD注釋限制了基因組結(jié)構(gòu)和進化的理解。長雄野生稻的T2T基因組提供了SD研究更準(zhǔn)確的參考信息。使用BISER工具一共鑒定出30.2 Mb的SD，并發(fā)現(xiàn)在基因組水平并非均勻分布。SD在1/4/3/2號染色體中含量更高，在9/10/5號染色體中更少。該不均勻分布提示1/4/3/2號染色體可能對水稻進化中的作用方式為先前未知的。
使用BLASTP在SD區(qū)域鑒定重復(fù)基因，一共發(fā)現(xiàn)4,179對同源基因，1,233對為高度匹配，并發(fā)現(xiàn)大部分SD是近期發(fā)生（Ks=0.3）。GO分析顯示這些等位基因與細胞氨基酸代謝、羧酸代謝和輔因子結(jié)合相關(guān)。
長雄野生稻基因組的片段復(fù)制分析
NBS基因家族和轉(zhuǎn)錄因子
核苷酸結(jié)合位點-亮氨酸富集重復(fù)單元（NBS-LRR）蛋白為植物對抗病原體的抗性蛋白的最大的家族。11種水稻的NBS-LRR分析發(fā)現(xiàn)，長雄野生稻有654 NBS-LRR基因，比其他物種基因更少，即抗性基因更少。說明長雄野生稻對病原體的識別和免疫識別的能力進化。
稻屬內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子差異分析，長雄野生稻擁有86個家族共計2095個轉(zhuǎn)錄因子，其中ERF轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多（857個），其次是bHLH（128個）、NAC（120個）、MYB（119個）和C2H2（116個）。
總結(jié)
本研究依托華大序風(fēng)CycloneSEQ平臺成功組裝了長雄野生稻的端粒到端粒(T2T)的基因組，該基因組包含完整的12條染色體及24個端粒。與已發(fā)表的稻屬其他的參考基因組比較發(fā)現(xiàn)栽培稻和野生稻之間眾多的基因組結(jié)構(gòu)變異。本研究還對長雄野生稻與稻屬其他物種的基因組進行片段重復(fù)基因、NBS-LRR抗性基因和轉(zhuǎn)錄因子的比較分析。長雄野生稻全基因組組裝的更新成果對高價值的表型性狀關(guān)聯(lián)基因研究提供了證據(jù)基礎(chǔ)，對未來育種和非洲水稻與稻屬進化研究搭建了高價值平臺。
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https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.09.05.611405v1
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