近期，華大智造針對(duì)DNBSEQ平臺(tái)的甲基化建庫(kù)與測(cè)序進(jìn)行了全面升級(jí)，推出新一代建庫(kù)產(chǎn)品MGIEasy 全基因組甲基化文庫(kù)制備試劑盒V3.0（MGIEasy Whole Genome Methylation Sequencing Library Prep Kit V3.0，以下簡(jiǎn)稱WGMS V3.0）。WGMS V3.0以雙鏈加接頭方法為基礎(chǔ)，對(duì)經(jīng)物理打斷方法獲得的DNA片段進(jìn)行建庫(kù)，并適配酶法轉(zhuǎn)化，將非甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），搭配DNBSEQ平臺(tái)，能夠?qū)崿F(xiàn)單堿基精度地解析DNA甲基化狀態(tài)，構(gòu)建精細(xì)的全基因組甲基化圖譜。WGMS V3.0可為大人群表觀組研究、表觀遺傳基礎(chǔ)科研、動(dòng)植物研究、疾病甲基化標(biāo)志物篩選、藥物研發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域提供高效而準(zhǔn)確的全基因組甲基化建庫(kù)方法。
當(dāng)前，WGMS V3.0已適配MGISEQ-2000平臺(tái)，結(jié)合MGISEQ-2000平臺(tái)的升級(jí)算法，測(cè)序時(shí)可以不添加平衡文庫(kù)，實(shí)現(xiàn)0平衡文庫(kù)的純甲基化文庫(kù)測(cè)序。此外，華大智造研發(fā)團(tuán)隊(duì)針對(duì)WGMS V3.0適配DNBSEQ-T7已啟動(dòng)最后的穩(wěn)定性測(cè)試，更多實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)將持續(xù)分享，敬請(qǐng)期待。
產(chǎn)品亮點(diǎn)
可獲得更大文庫(kù)插入片段，支持PE150測(cè)序
起始量范圍廣，可兼容100~1000ng gDNA建庫(kù)起始量，5~20ng cfDNA建庫(kù)起始量
兼容多種樣本類型，包括血液、新鮮組織、細(xì)胞樣本、FFPE樣本、血漿樣本，以及常見動(dòng)植物gDNA樣本
建庫(kù)采用磁珠純化方法，全流程適配自動(dòng)化設(shè)備
搭配DNBSEQ平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)利用率高，基因組覆蓋度高，甲基化檢測(cè)一致性高
實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)
1、0平衡文庫(kù)，數(shù)據(jù)利用率高，輕松實(shí)現(xiàn)“1庫(kù)1 lane”
采用3個(gè)不同批次的WGMS V3.0構(gòu)建NA12878標(biāo)準(zhǔn)品的DNA甲基化文庫(kù)，不加平衡文庫(kù)，平行上機(jī)MGISEQ-2000 ECR7.0（搭配SM測(cè)序試劑）和ECR7.1（搭配SM 2.0測(cè)序試劑），PE150測(cè)序，單lane reads產(chǎn)出基本穩(wěn)定在400 M左右，單個(gè)文庫(kù)可獲得約120G的原始下機(jī)數(shù)據(jù)，可輕松實(shí)現(xiàn)“1庫(kù)1 lane”，且測(cè)序質(zhì)量良好，SM測(cè)序試劑Q30穩(wěn)定在89%左右，SM2.0測(cè)序試劑Q30穩(wěn)定在94%左右，Q40穩(wěn)定在87%左右（表1），Read1和Read2的測(cè)序堿基分布線幾乎穩(wěn)定在一條水平線上，測(cè)序質(zhì)量高（圖1）。
表1. WGMS V3.0適配MGISEQ-2000平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)
圖1. Read1和Read2的測(cè)序堿基分布
2、基因組覆蓋度高
不同文庫(kù)的MGISEQ-2000 PE150測(cè)序數(shù)據(jù)clean rate≥95%，截取110Gb clean data進(jìn)行分析，平均測(cè)序深度均≥30x，搭配ECR7.0軟件版本測(cè)序儀的全基因組20×coverage≥85%，ECR7.1軟件版本測(cè)序儀的全基因組20×coverage≥90%。質(zhì)控文庫(kù)Lambda DNA非甲基化C轉(zhuǎn)U的轉(zhuǎn)化率≥99%，不同批次建庫(kù)試劑盒及不同測(cè)序試劑版本下的NA12878標(biāo)準(zhǔn)品DNA的全基因組甲基化率保持在相當(dāng)?shù)乃剑?3~45%）。
表2. WGMS V3.0適配MGISEQ-2000平臺(tái)的測(cè)序數(shù)據(jù)
3、文庫(kù)插入片段大
試劑盒適配轉(zhuǎn)化損傷小的酶法轉(zhuǎn)化，增大了文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度，更好地支持PE150測(cè)序。不同批次建庫(kù)試劑盒構(gòu)建的NA12878標(biāo)準(zhǔn)品DNA甲基化文庫(kù)的插入片段（主峰約280bp）表現(xiàn)一致。
圖2. DNA甲基化文庫(kù)的插入片段大小
4、M-bias低
試劑盒優(yōu)化了末端修復(fù)反應(yīng)體系和步驟，降低了Reads末端M-bias堿基個(gè)數(shù)。SM2.0版測(cè)序試劑搭配ECR7.1軟件版本所獲結(jié)果顯示，不同批次建庫(kù)試劑盒構(gòu)建的NA12878標(biāo)準(zhǔn)品DNA甲基化文庫(kù)的M-bias表現(xiàn)一致，Bottom Strand 和Top Strand的Read1和Read2甲基化率幾乎重合。
圖3. M-bias圖
5、甲基化檢測(cè)一致性高
分析各文庫(kù)在4×測(cè)序深度下檢測(cè)到的獨(dú)有和共有的CpG位點(diǎn)，SM2.0版測(cè)序試劑搭配ECR7.1軟件版本所獲結(jié)果顯示，3個(gè)批次試劑盒所建的甲基化文庫(kù)的CpG位點(diǎn)覆蓋一致性>95%（圖4），不同建庫(kù)試劑盒批次間的甲基化率一致性可高達(dá)94%（圖5）。
圖4. lot1、lot2、 lot3 文庫(kù)的CpG位點(diǎn)覆蓋一致性
圖5. lot1、lot2、 lot3 文庫(kù)間的CpG位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)性分析
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