近日，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院聯(lián)合中科院生物物理研究所和深圳三院國家傳染病臨床研究中心在Nature Communications雜志發(fā)表慢乙肝干擾素功能性治愈研究的最新成果，題為“Interferon stimulated immune profile changes in a humanized mouse model of HBV infection”。該研究中的單細(xì)胞測序基于華大智造DNBelab C4單細(xì)胞文庫制備試劑盒和DNBSEQ-T7、MGISEQ-2000測序平臺。
該研究成功構(gòu)建了一種能真實應(yīng)答人干擾素的huIFNAR小鼠模型，分析得到人干擾素的組織特異性應(yīng)答譜，在該小鼠模型中證明干擾素能夠降低血清HBsAg水平，并發(fā)現(xiàn)特定細(xì)胞類型可能在實現(xiàn)HBV治愈中起到重要作用。
干擾素是目前實現(xiàn)乙肝功能性治愈公認(rèn)的臨床藥物。在核苷經(jīng)治及兒童慢乙肝等特殊人群中，干擾素治療可獲得高比例HBsAg轉(zhuǎn)陰，但干擾素實現(xiàn)乙肝功能性治愈機制未明，這主要受限于缺少相關(guān)的動物模型。干擾素具有明顯種屬特異性，一方面，人和小鼠干擾素氨基酸序列相去甚遠(yuǎn)，以I型干擾素為例，在序列上，小鼠中沒有與人完全一致的干擾素。同時，臨床上人IFNα2在小鼠中沒有相同對應(yīng)物。另一方面，小鼠干擾素受體與人干擾素受體在序列上相似性只有一半左右（圖1）。因此，建立人干擾素功能研究的替代性模型極為迫切。
圖1：I型干擾素序列比對以及人和小鼠I型干擾素受體胞外結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對
該研究首先通過基于CRISPR/cas9的敲入策略構(gòu)建了I型干擾素受體人源化小鼠(huIFNAR小鼠)。并體外通過huIFNAR小鼠和人PBMCs對人IFN刺激的基因表達(dá)譜對比實驗（圖2），證明該小鼠模型可模擬人對人源IFN刺激的免疫應(yīng)答特征，支持了該huIFNAR小鼠可作為人干擾素研究的替代模型。
圖2：huIFNAR敲入策略示意圖以及huIFNAR小鼠與人PBMCs對人IFN刺激反應(yīng)的相似性分析
隨后，該團隊研究了腦、血、肺、心、肝、脾、腎、肌肉、腸9個主要組織對人干擾素刺激的體內(nèi)應(yīng)答圖譜。首次揭示了健康個體對人干擾素應(yīng)答的組織和器官特異性，其中，血液和肝臟免疫應(yīng)答最明顯，而腸道和腦免疫應(yīng)答最弱（圖3）。該研究所描繪的器官和組織特異性干擾素應(yīng)答圖譜尚未在健康人體中報道。
圖3：人PEG-IFNα2作用后的9大組織特異性應(yīng)答圖譜
通過使用DNBelab C4單細(xì)胞文庫制備試劑盒和DNBSEQ-T7、MGISEQ-2000測序儀對肝臟CD8T細(xì)胞群進行更為詳盡亞群分析，發(fā)現(xiàn)Teff CD8T細(xì)胞群的比例顯著增加。Teff CD8T主要富集細(xì)胞分化調(diào)節(jié)、趨化性和趨化因子信號傳導(dǎo)、白細(xì)胞介素12產(chǎn)生、T細(xì)胞受體和Toll樣受體信號簇相關(guān)分子細(xì)胞通路。推斷huIFNAR-IFNα2可促使Teff CD8T細(xì)胞表現(xiàn)出在激活、細(xì)胞毒性和趨化作用方面功能的提升。但未預(yù)料到的是，Teff CD8T細(xì)胞也表達(dá)耗竭相關(guān)特異性基因（Lag3、Havcr2、Pdcd1和CTLA4）以及呈現(xiàn)耗竭基因表達(dá)譜特征。Teff CD8T中耗竭生物標(biāo)志物的共表達(dá)可能會降低其在體內(nèi)抑制乙型肝炎病毒的作用效力（圖4）。
圖4：單細(xì)胞測序揭示慢性干擾素刺激介導(dǎo)的CD8T細(xì)胞亞群變化特征
最后，該研究構(gòu)建AAV-HBV慢性HBV感染模型，評價人干擾素的抗HBV作用。人長效干擾素治療15周可顯著降低HBsAg和HBeAg，甚至實現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)化，成功模擬了干擾素在臨床上的長期治療效果。通過單細(xì)胞測序和流式細(xì)胞技術(shù)對可能的機制進行了探索。研究發(fā)現(xiàn)干擾素激活肝內(nèi)單核細(xì)胞和效應(yīng)記憶CD8T細(xì)胞從而起到降低HBsAg的作用（圖5）。同時該研究也發(fā)現(xiàn)該群CD8T細(xì)胞中高表達(dá)PD-1等抑制性分子，這也支持干擾素聯(lián)合PD-1抑制劑可能是實現(xiàn)乙肝功能性治愈的潛在治療方案。
圖5：人PEG-IFNα2抗HBV作用研究
該研究建立的huIFNAR小鼠能夠真實地響應(yīng)人干擾素刺激，同時在該模型中發(fā)現(xiàn)PEG-IFNα2治療成功抑制肝內(nèi)HBV復(fù)制，實現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)化，該小鼠模型為研究干擾素體內(nèi)的功能和評估干擾素實現(xiàn)HBV功能性治愈機制提供了平臺（圖6）。
圖6：文章圖形摘要
廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院王亞萍，郭栗良子，石靜蓉，中科院生物物理研究所李靖云博士，深圳三院國家傳染病臨床研究中心文艷玲博士和廣州欣意生物古國銘為本論文共同第一作者。廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院李鋒研究員和唐小平教授為共同通訊作者。
*本文部分轉(zhuǎn)載自病毒學(xué)界
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